Dr.Luis Sanmartino-Dra.SandraConde
Instituto de Patobiología
Area de Bacteriología-Sector Brucelosis

Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agrónomicas (CICVyA)

Indice

Primera parte

 

Agente Causal
Biovariedades
Patogénesis
Vías de entrada
Vías de eliminación
Vías de infección
Infección de un establecimiento
Latencia en terneras

Segunda parte

Diagnóstico 
Diagnóstico Clínico
Toma de muestras
Diagnóstico bacteriológico
Diagnóstico serológico 
Diagnostico de Brucela ovis, B.canis

Tercera parte

Secuencia de anticuerpos en bovinos
Pruebas serológicas
BPA
Prueba de Wright
Prueba de anillo en leche
Fijación de complemento
ELISA

Polarización fluorescente
Nuevas técnicas

Cuarta parte

Implicancia Zoonotica de Brucelosis  
Prevención en animales
Prevención en el humano
Vacunas
Vacunas antibrucélicas
Pérdidas econónicas

 

 

 

Tanto los animales infectados como los vacunados con
S19 producen IgM e IgG
Bovinos vacunados
IgM aparecen entre 4-6 días postvacunación
Su concentración va disminuyendo sin anularse por meses o años
IgG aparecen después que las IgM
Alcanzan títulos más bajos, descienden rápidamente y
desaparecen en animales jóvenes.  Pueden persistir en adultos
Bovinos infectados
IgM son las primeras en declinar o desaparecer
IgG alcanzan niveles más altos que la IgM, luego disminuyen y persisten
 mientras exista infección
TAMIZ
ANTIGENO BUFERADO EN PLACA - BPA
BASICA OPERATIVA
TEST DE WRIGHT
COMPLEMENTARIAS
2 - MERCAPTOETANOL
VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA
ANILLO EN LECHE
DEFINITORIA
FIJACION DE COMPLEMENTO
NUEVAS TECNICAS
ELISA COMPETICION
 POLARIZACION FLUORESCENTE

 

Tamiz o Screening:  BPA, RB, RAP

Clásicas: Wright, Huddlesson
Complementarias: Rivanol, 2-ME, FC
Vigilancia Epidemiológica: GD, Ring Test
Nuevas técnicas: I-ELISA, C-ELISA,  FPA

2-MERCAPTOETANOL

Fijación del complemento por la unión antígeno-anticuerpo (no existe hemólisis) Þ Reacción positiva
Falta de anticuerpos Þ complemento libre Þ Reacción negativa

   

Complemento fijado al anticuerpo, no disponible para lisar los eritro

 

Falta de anticuerpos. Complemento disponible para  lisar los eritrocitos
FIJACION DE COMPLEMENTO (FC) (50% hemólisis)indice
 
Alta especificidad y sensibilidad
Detecta casi exclusivamente anticuerpos IgG1
IgG2 no fijan el complemento
IgM fijan el complemento se inactivan por calor
Requiere laboratorios equipados y personal capacitado

Unidad hemolítica 50%, es la cantidad de complemento necesaria para obtener 50% de hemólisis, de 67 millones de hematíes de oveja, sensibilizados con suero antihematíes de oveja preparado en conejo (hemolisina) en un volumen final de 1ml.
FIJACION DE COMPLEMENTO (FC)
Titulación de hematíes de oveja
Sangre de oveja en solución Alsever
10ml sangre Þ 2ml hematíes + 70ml SBV Þ 6.7x108 hematíes/ml  Þ Suspensión 2.8%
Hemolisina
Suero antihematíes de oveja Þ anticuerpos alto y bajo PM
Anticuerpos de alto PM Þ mayor capacidad para sensibilizar  hematíes para la  acción del complemento
Complemento Þ Suero de cobayo alimentado c/vegetales
Antígeno Þ de tubo

POLARIZACION FLUORESCENTE
ELISA                COMPETICION
                         INDIRECTA
Objetivos
Aumentar sensibilidad y especificidad.
 Eliminar subjetividad.
 Diferenciar animales infectados de vacunados.
 Económica, Sencilla, Rápida ...
Capaces de distinguir animales infectados con B. abortus de vacunados con S19 e infectados con otras bacterias gram ( - ) que pueden tener reacción cruzada
Prueba homogénea que elimina la necesidad de pasos de lavado para eliminación de reactivos en exceso.
 Reactivos adicionados secuencialmente en la solución.
 Tiempo total del test no excede los 5 minutos por suero. 
IELISA in serum  (Nielsen et al., 1984)
IELISA in milk (diluted 1:2)
IELISA ovis (antigen B.ovis)
CELISA O-polisacharide (Nielsen et al., 1989)
CELISA LPS (Nielsen et al., 1995)
ENZIMO INMUNOENSAYO - ELISA
 IELISA
                 OD test sample x100
%  P = ------------------------------- =
                OD mean of BAC ++ 
 CELISA
                           OD test sample x100
%  I = 100  -  ------------------------------- =
                                OD mean of BACc
Brucella abortus - estrutura antigênica

 

ENZIMO INMUNOENSAYO DE COMPETENCIA (CELISA)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
En ausencia de anticuerpos anti-Brucella el M84 (Anticuerpo monoclonal de ratón (Mab) específico para un epitope de la porción o-polisacarido del antígeno sLPS) se une al antígeno pegado en la placa.
Suero positivo
Si el suero contiene anticuerpos específicos, estos compiten con el M84 por el sitio en el epitope inhibiendo la unión de estos últimos en la porción O-polisacarido del antígeno sLPS.
Suero de animal vacunadocon S19
Estos anticuerpos no compiten por el sitio en el Antígeno debido a su baja especificidad y afinidad, excepto en vaquillonas que fueron testeadas antes de los 3 meses de vacunación y animales donde, la infección con S19, es persistente .
 

ENZIMO INMUNOENSAYO DE COMPETENCIA (CELISA)

Detección de anticuerpos especificos de Brucella en suero.
Capaz de distinguir animales infectados con Brucella de animales vacunados con S19 de B. abortus.
Fijado de antígeno overnight 4ºC 4 lavados
Antígeno usado es un lipopolisacarido (sLPS) extraído una cepa lisa 1119 de B. abortus
Adicionar suero
y monoclonal 30 minutos 25ºC 4 lavados
Anticuerpo monoclonal de ratón (Mab) específico para un epitope de la porción o-polisacarido del antigeno sLPS
Adicionar conjugado 30 minutos 25ºC 4 lavados
Anticuerpo IgG antiratón extraído de cabras conjugado con una peroxidasa.
Sustrato cromógeno 10 minutos temp.amb.
Lectura Filtro 405nm
Aplicaciones del FPA en el diagnóstico de brucelosis

  • Diagnóstico serológico de la brucelosis bovina
  • Diagnóstico con sangre entera(bovino)
  • Diagnóstico de la brucelosis porcina
  • Diagnóstico de la brucelosis caprina
  • Diagnóstico de la brucelosis en bisón
  • Diagnóstico con leche bovina


Las moléculas en solución rotan, al azar, a una taza  inversamente proporcional a su tamaño.
La taza de rotación puede ser medida en el plano horizontal y vertical usando una marca fluorescente y luz polarizada.
La taza de rotación de la pequeña molécula de antígeno marcado con la sustancia fluorescente se alterara con la unión del anticuerpo y este cambio podrá ser medido.
Los resultados son expresados como unidades de milipolarización  (mP) del suero frente al antígeno.
Cálculo de las unidades de mP de cada muestra
mP = (Iv - (Ih x G) / (Ih x G) x 1000
Iv = intensidad vertical de la luz
Ih = intensidad horizontal de la luz
G = Factor de polarización