VET-UY Agro y Veterinaria - Artículos de Apicultura - 013. Loque Americana de las abejas: Características y diagnóstico de la enfermedad.

Ing. Sebastián E. Borracci1, Lic. Pablo A. Chacana1, Ing. Alejandra Palacio2 & Dr. Horacio R. Terzolo1.

La Argentina ocupa el tercer lugar como país productor de miel con una participación del 6,7% (93.000 toneladas anuales) del mercado mundial, siendo aproximadamente el 80% de su producción exportado principalmente a países como Estados Unidos y Alemania, generando un ingreso de divisas de aproximadamente 100 millones de dólares por año.

La Loque Americana es una de las enfermedades más serias e infecciosas de las colmenas por su alto grado de patogenicidad y virulencia. La misma causa severos daños económicos al sector apícola en muchos países productores de miel.

En el Workshop sobre “Loque Americana” llevado a cabo durante el año 1994, se concluyó que de no implementarse un programa para su control, las pérdidas podrían ser superiores a diez millones de dólares.

Esta enfermedad es más conocida mundialmente por su denominación inglesa como “American foulbrood”. Afecta a la abeja domestica (Apis mellifera L.) durante el estado larval, siendo las abejas adultas portadoras asintomáticas pasivas o activas.

El agente causal es Paenibacillus larvae (P.larvae White), una bacteria flagelada de 2,5 a 5 µ de largo y 0,4 a 0,8 µ de ancho. Su característica principal es la de formar endosporas muy resistentes. Estas últimas al poseer doble pared se pueden detectar con coloraciones clásicas para esporas, como la de Shaeffer y Fulton (Baker, 1970). Al observarlas sin coloración con el microscopio de contraste de fase éstas presentan el clásico movimiento browniano. Estas esporas tienen tolerancia a muy altas temperaturas, resisten 30 minutos a 100ºC y 15 minutos a 120ºC. Resisten la acción de desinfectantes químicos como el cloro, productos basados en yodo y radiación ultravioleta durante 20 minutos de exposición. Además, de acuerdo a las condiciones de conservación, pueden sobrevivir en el ambiente por un muy largo tiempo, y recién luego de 30 años comienzan a presentar una disminución de la viabilidad (Bruno, 1999).

Desde el punto de vista taxonómico antiguamente se distinguieron dos especies bacterianas, una causante de la clásica “escama” de la Loque Americana, el denominado Bacillus larvae (White, 1906), y otra poco común causante de la “escama pulverulenta” o Bacillus pulvifaciens (Katznelson, 1950). Actualmente estas dos especies bacterianas se encuadran dentro de la misma especie, Paenibacillus larvae, en la cual se reconocen dos subespecies larvae y pulvifaciens. Estas dos subespecies bacterianas están estrechamente relacionadas, aunque según Heyndrickx et al. (1996) pueden diferenciarse por pruebas bioquímicas.

Las esporas son infectivas y responsables del inicio del ciclo de la enfermedad una vez que las ”larvas“ ingieren o consumen alimento contaminado con las mismas. Las abejas nodrizas pueden albergar a las esporas tanto sobre la superficie corporal como dentro de su tracto digestivo. De este modo, al alimentar a las larvas, las nodrizas portadores transmiten oralmente la infección o inclusive lo hacen indirectamente contaminando a la celda. Una vez dentro del intestino de la larva, las esporas germinan después de un período variable que fluctúa entre las 24 y 48 horas, originándose así las formas vegetativas. Estos bacilos flagelados se reproducen y desarrollan dentro del tracto digestivo de la larva. Cuando la larva pasa al siguiente estadío, durante el desarrollo de la “pre-pupa” (Woodrow & Holst, 1942; Bailey 1984), estos bacilos penetran activamente la membrana peritrófica y la pared intestinal, produciendo la invasión bacteriana de la hemolinfa (Bailey & Ball, 1991). A partir de ese momento la bacteria sigue desarrollándose y reproduciéndose rápidamente, ocasionando la muerte de la cría por septicemia generalizada (Bambrick, 1964). La muerte puede ocurrir en el estado de prepupa o pupa y luego de transcurridos varios días la larva se deseca y adquiere un color negro. En esta etapa se denomina “escama” y tiene un muy alto poder infectivo (Bailey & Ball, 1991). En resumen, el ciclo de la enfermedad (ver Figura 1) puede describirse de la siguiente manera:

Figura 1. Momento que afecta la Loque A. en el ciclo de vida de la abeja. Diseminación y distribución de la enfermedad

Loque Americana de las abejas: Características y diagnóstico de la enfermedad. Ing. Sebastián E. Borracci, Lic. Pablo A. Chacana, Ing. Alejandra Palacio & Dr. Horacio R. Terzolo (2004)

La prepupa o pupa muerta va adquiriendo paulatinamente una coloración cada vez más oscura debido a la pigmentación propia de P. larvae. Esta “escama “ puede llegar a contener hasta 2,5 billones de esporas (Bailey & Ball, 1991). A partir de la formación de las “escamas” el material se torna muy infectivo y las mismas son una importantísima fuente de diseminación de las esporas. Bambrick y Rothenbuhler, (1961) describen que con muy pocas esporas es posible infectar una larva de menos de 24 horas de vida. Además, las mismas abejas por medio del pillaje, deriva y alimentación difunden la infección en la propia colmena y entre diferentes apiarios (Hornitzky, 1998). En las condiciones actuales de manejo comercial de las explotaciones apícolas, en las cuales es común el traslado de materiales entre diversas regiones y países, el hombre constituye un eslabón fundamental en la diseminación de la Loque Americana.

La distribución de esta enfermedad es mundial, aunque pocos países de América del Sur y del continente africano no reportan su presencia (Nixon, 1982). La primera persona del continente americano en reconocerla fue Moses Quinby en los Estados Unidos (Root, 1950). En nuestro país se detectó en el año 1989 (Alippi y Nuñez, 1991; Alippi, 1992 ) y se sugiere que probablemente el origen de esta enfermedad fue el ingreso de material vivo, importado proveniente de los EE.UU. Datos posteriores indican una diseminación de esta enfermedad, en la mayoría de las provincias de mayor importancia en producción Apícola, con incidencias hasta del 30% descriptas en el Partido de Tandil (Del Hoyo y col., 1993). Este es uno de los de los partidos de mayor importancia en la producción apícola y además la Provincia de Buenos Aires concentra el 60% de la producción nacional de miel. Esta enfermedad constituye una seria amenaza para la industria apícola en general y limita la comercialización de sus productos.

La Loque Americana se puede identificar claramente observando los marcos de cría de los panales afectados. Estos marcos cuando están afectados por la Loque Americana clásica, presentan una distribución irregular. Así, se pueden detectar celdas infectadas y sanas en el mismo panal. De acuerdo con el grado de infección que presenten la visualización suele presentar un aspecto de mosaico, o sea la presencia de celdas afectadas intercaladas con otras sanas, lo que a campo se describe como panales de “aspecto salteado”. De este modo, cuando se observan con mayor detenimiento, algunas de las celdas se encuentran con crías vivas mezcladas con otras muertas, algunos opérculos hundidos y otros de aspecto grasiento, pudiendo también visualizarse perforaciones irregulares debido a la limpieza sanitaria parcial que efectúan las mismas abejas. Es importante mencionar que las primeras infecciones son muy difíciles de detectar en el campo. La muerte principalmente de pre-pupas y en segundo lugar de pupas, se produce luego de ser operculada la celda. La cría muere una vez finalizada su etapa larval. Va cambiando de color y consistencia, primero desde el pardo amarillento, luego un pardo oscuro y por último un negro pardusco; durante este cambio de coloración la larva se va achicando, deformando y finalmente se adhiere hacia uno de los lados de la celda, hasta adquirir el aspecto de una costra o “escama”. La misma es de difícil extracción, tanto para las abejas como para el apicultor (Bruno, 1999), de modo que al intentar extraerla generalmente se suele romper. En algunos casos la lengua o glosa permanece adherida en forma vertical cruzando la celda; esto último sucede cuando la muerte ocurre pasado el estadio de pre-pupa. Esta escama es en realidad un cultivo puro de billones de esporas y constituye la principal fuente de difusión de la infección. En general sólo se afecta la cría de las abejas obreras y ocasionalmente la de los zánganos y las reinas (Anónimo, 1967).

Esta enfermedad es tan típica que su detección puede efectuarse directamente en el campo, aunque con la ayuda del laboratorio se puede obtener una confirmación inequívoca del diagnóstico. Su determinación en el campo puede realizarse al localizar cuadros de cría con el aspecto y los síntomas clásicos de la Loque Americana que fueron descriptos anteriormente. Se extrae una de las larvas afectadas de apariencia viscosa y se la macera con un palillo. Al estirarla se forma un largo filamento de 2,5 hasta 4 cm que tiene el aspecto y consistencia de un “chicle”. Si se abre la colmena en los casos avanzados de esta enfermedad, es muy notable percibir un fuerte olor pútrido y penetrante que es similar al de la cola de carpintero.

Una vez que se detecta la clásica enfermedad en el campo, lo ideal es que se tomen las correspondientes muestras para su posterior confirmación en el laboratorio de bacteriología. Generalmente se pueden remitir al laboratorio directamente los panales afectados tomando la precaución de envolverlos con papel y bolsas plásticas o envases de cartón, para evitar así la diseminación de las esporas. El diagnóstico de laboratorio utiliza técnicas para detección, aislamiento e identificación de Paenibacillus larvae a partir de cultivos realizados con restos larvales (A. Alippi, & Nuñez, 1990) o esporas contenidas en miel (van der Horst, 1998). Dado que las esporas de las escamas son altamente resistentes y se conservan inalteradas por muy largo tiempo, para el estudio de este agente bacteriano no se necesitan utilizar medios de transporte. Para conservar el material por largo tiempo directamente se pueden congelar los panales afectados. Al realizar este procedimiento, luego al descongelar para su cultivo, la escama se separa más fácilmente de las paredes de la celda.

Dado que el P. larvae es un agente patógeno altamente especializado de la larva de la abeja, las esporas sólo pueden germinar y desarrollar formas vegetativas in vitro mediante el empleo de medios de cultivo muy ricos en elementos nutritivos. De hecho, una característica diferencial de P. larvae es su incapacidad para desarrollar en medios de cultivo simples, que usualmente permiten la germinación de esporas bacterianas de la mayoría de las cepas saprófitas de Bacillus spp. Es por ello adecuado el uso de una base rica como infusión cerebro-corazón (Goodwin, 1994), Columbia agar con el agregado de sangre de ovino (Heyndrickx et al., 1996), agar base sangre con sangre equina (Nordström & Fries, 1995) y agar MYPGP que tiene como base al medio Müller-Hinton (Dingman & Stahly, 1983). Los componentes indispensables para el crecimiento de P. larvae son la tiamina o vitamina B1, el extracto de levadura y varias peptonas. Para lograr la esporulación se describe el agregado de glucosa y piruvato de sodio (Dingman et al., 1983). También se han diseñado medios de cultivo específicos y selectivos, especialmente desarrollados con ácido nalidíxico para la búsqueda de P.larvae en muestras con bajo número de esporas y que están contaminadas con otras bacterias (Alippi, 1996). Estos medios selectivos no se requieren para el aislamiento a partir de escamas, dado que las mismas per se constituyen un cultivo puro de P. larvae.

Para la identificación de cultivos de P. larvae (Alippi, 1992) se pueden realizar pruebas bioquímicas específicas con el agregado a los medios de crecimiento de tiamina a razón de 1 µg/mL, obteniéndose los siguientes resultados: catalasa negativo, hidrólisis de la esculina positivo, crecimiento en agar citrato de Simmons negativo, producción de ácido sulfhídrico negativo, producción de indol negativo, reacción de Voges-Proskauer negativo, gelatinasa positivo, ß-galactosidasa u orto.nitro.fenil-ß-D-galactopiranosido (ONPG) negativo, ureasa negativo, no hidroliza al almidón y fermenta la manosa, glicerol, ribosa y trehalosa, pero no fermenta a la sacarosa y xilosa. Para la diferenciación de P. larvae larvae y P. larvae pulvifaciens se utilizan las siguientes pruebas bioquímicas (Tabla 1): dependencia de la tiamina (1 µg/mL) para crecimiento, crecimiento a 20°C, fermentación del manitol y salicina e hidrólisis de la arginina (Heyndrickx et al., 1996; Sneath, 1986).

Tabla 1: Pruebas bioquímicas para la diferenciación de P. larvae subspp larvae y pulvifaciens. Según Heyndrickx et al., (1996).

Paenibacillus

larvae subspp.

Dependencia de Tiamina

Crecimiento a 20°C

Manitol

Salicina

Arginina

larvae

pulvifaciens

Alippi, A. M. 1992. Detección de Bacillus larvae en poblaciones mixtas de esporas bacterianas a partir de restos larvales. Microbiologia SEM 8, 115-118.

Alippi, A. M.; Nuñez, L. 1990. Técnicas de laboratorio para el aislamiento e identificación de Bacillus larvae White, agente causal de la Loque americana. Circ. Int. CIC Año 2 - Nº 6.

Alippi, A. M.; Nuñez, L. 1991. La loque americana en Argentina. Vida Apícola 49, 20-24.

Alippi, A. M. 1996. Caracterización de aislamientos de Paenibacillus larvae mediante tipo bioquímico y resistencia a oxitetraciclina. Rev. Arg. Microbiol. 28: 197-203.

Anónimo. 1967. Identifying bee diseases in de apiary. Editado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América. pp.22.

Bailey, L.; Ball, B. V. 1991. Honey Bee Pathology. Academic Press; London, UK, segunda edición 193pp.

Bambrick, J. F.; Rothembuhler, W. C. 1961. Resistance to American fouldbrood in honey bees. IV. The relationship between larvae age at inoculation and mortality in a resistant and in a susceptible line. J. Insect Pathol. 3 (4) : 381-390.

Bruno, S. B. 1999. Enfermedades en la Etapa Larval: Loque Americana. Ciencia y Abejas 29: 2-7.

Dingman, D. W.; Stahly, D. P. 1983. Medium Promoting Sporulation of Bacillus larvae and Metabolism of Medium Components. Appl. Environ. Microbiol. 46: 860-869.

Del Hoyo M.; Basualdo, M.; Torres, J.; Bedascarrasbure, E. L. 1998. Use of DHT-equipment disinfection of AFB-contaminated Beehive materials in Argentina. Am. Bee. J. 138 (10) : 738-740.

Goodwin, R. M. 1994. Detection of American Fouldbrood using the plate culture technique. Laboratory manual.

Hornitzki, M. A. Z. 1998. The spread of Paenibacillus larvae subsp larvae infections in an apiary. J..Apic. Res. 37(4): 261-265.

Heyndrickx, M.; Vandenmeulebroecke, K.; Hoste, B.; Janssen, P.; Kersters, K.; De Vos P.; Logan, N. A. Ali, N. 1996. BERKELEY RCW. 1996. Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus) pulvifasciens (Nakamura 1984) Ash et al. 1994, a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White, 1906) Ash et al. 1994, as a subspecies of P. larvae, with emended descriptions of P. larvae as P. larvae subsp. Larvae and P. larvae subsp. Pulvifaciens. Int. J. Syst. Bacteriol. 46 (1): 270-279.

Katznelson, H. 1950. Bacillus pulvifaciens (n. sp.), an organism associated with powdery scale of honeybee larvae. J. Bacteriol. 59:153-155.

Nixon, M. 1982. Preliminary world maps of honeybee diseases and parasites. Bee World 63 (1) : 23-42.

Nordstrom, S.; Fries, I. 1995. A comparison of media and cultural conditions for identification of Bacillus larvae in honey. Journal Apic. Res. 34(2): 97-103.

Sneath, P. H. A. 1986. Endospore-forming Gram-Positive Rods and Cocci. In: Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 2. Ed. Williams & Wilkins, Baltimore. p. 1104-1139.

Van der Horst. 1998. Determinación del número de esporas de P. larvae presentes en la miel. 18pp. Tesina para acceder al Título de Medico Veterinario. Facultad de Ciencias Veterinarias, Tandil.

White, G. F. 1906. The bacteria of the apiary, with special reference to bee diseases. Technical Series of United States Bureau of Entomology 14: 1-50.

Woodrow, Aw, Holst, Ec. 1942. The mechanism of colony resistance to American fouldbrood. J. Econ. Entomology 35 (3) : 327-330.