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EL ANALISIS COMPUTARIZADO DE IMAGENES COMO HERRAMIENTA DE DIAGNOSTICO EN LAS CIENCIAS VETERINARIAS

Portiansky, EL¹; Barbeito, CG^1,2, Gimeno EJ¹, Alonso, CR³ y Zuccolilli, GO³

1 Instituto de Patología; 2. Cátedra de Histología y Embriología; 3. Instituto de Anatomía. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata. Calle 60 y 118. 1900) La Plata, Argentina.

Direcciones para contactar con los autores

Dr. Portiansky: elporti@fcv.medvet.unlp.edu.ar
Dr. Barbeito: barbeito@fcv.medvet.unlp.edu.ar
Dr. Gimeno: ejgimeno@fcv.medvet.unlp.edu.ar
Dra Alonso: calonso@fcv.medvet.unlp.edu.ar
Dr. Zuccolilli: guoszucc@fcv.medvet.unlp.edu.ar

Resumen

El análisis de imágenes se ha convertido en una herramienta fundamental dentro de diversas áreas científicas. La Biología no está ajena y, por el contrario, ha tomado un papel preponderante dentro de esta tecnología. Los procesos, que hasta hace poco tiempo se apreciaban subjetivamente, hoy se expresan en forma numérica, brindando, de esta forma, la posibilidad de universalizar la información. El objetivo del presente trabajo fue demostrar la utilidad del análisis computarizado de imágenes para medir el área de marcación y la densidad óptica de tejidos marcados con técnicas histoquímicas. Para ello se utilizó un microscopio trinocular conteniendo una cámara de vídeo analógica conectada a una plaqueta digitalizadora residente en una computadora de alto rendimiento. Se utilizaron distintos tejidos (prostata, placenta, hipotálamo, aorta), provenientes de animales sanos o enfermos, a los que se les aplicaron métodos de tinción histoquímica (HQ) o inmunohistoquímica (IHQ). Los cortes teñidos fueron observados al microscopio y digitalizados por medio de un programa de análisis computarizado de imágenes. Luego de una serie de pasos específicos para exaltar exclusivamente el tejido histoquímicamente marcado, se procedió a su cuantificación, graficación y análisis estadístico. El método utilizado para la cuantificación de las reacciones colorimétricas permitió, no solo identificar estructuras sino, además, establecer su número o área de tinción y su densidad óptica. Sin dudas, un ojo experto nunca hubiese podido determinar los parámetros establecidos por la computadora.

Palabras clave: Análisis de imágenes, inmunohistoquímica, histoquímica, morfometría

Introducción

Ya no quedan dudas que el análisis de imágenes se ha convertido en una herramienta fundamental dentro de áreas científicas tan relevantes como la Física, Astronomía, Electrónica y la Geología. La Biología no está ajena a esta lista y, por el contrario, ha tomado un papel preponderante dentro de esta tecnología. Los procesos, que hasta hace poco tiempo se apreciaban subjetivamente, hoy se expresan en forma numérica, brindando, de esta forma, la posibilidad de universalizar la información. La Patología y la Fisiología, como ramas de la Biología, no pueden estar ajenas a estos adelantos tecnológicos. La Patología humana ha sacado provecho de esta técnica, principalmente en lo referente a morfometría tumoral, por las implicancias que involucran a este tema. Lamentablemente, no son muchos los trabajos realizados en Patología Veterinaria, alguno de los cuales pueden verse en páginas de Internet (1,2). Por su parte, el conocimiento de "lo normal" es la herramienta fundamental de la Patología y por lo tanto, la morfometría aplicada a la Fisiología es un requisito indispensable. Es cierto que muchos parámetros morfométricos pueden cuantificarse con métodos sencillos que requieren de un costo mínimo para su ejecución. No obstante, cuando trabajamos con técnicas modernas de investigación y diagnóstico, como la inmunohistoquímica (IHQ), expresiones tales como: débilmente o altamente teñido, ya no pueden admitirse como válidas, si queremos trabajar en un mundo científico competitivo.

El objetivo del presente trabajo fue demostrar la utilidad del análisis computarizado de imágenes en la medición del área de marcación y la densidad óptica de tejidos teñidos con técnicas histoquímicas y con ello arribar al diagnóstico de posibles variaciones fisiológicas y alteraciones patológicas.

Materiales y Métodos

Para realizar los estudios propuestos, se utilizó material de archivo, incluído en parafina, proveniente de diferentes experimentos. Así, se tomaron cortes histológicos inmunomarcados tendientes a determinar: (a) el efecto patológico inducido por la aplicación de estrógenos en la próstata del novillo vacuno; (b) las características celulares de la subinvolución placentaria canina y (c) los aspectos morfológicos y fisiológicos de las poblaciones de neuronas GnRH del diencéfalo del coipo (Myocastor coypus). Finalmente, (d) se determinó el área y distribución de colágeno I y III en aortas de bovinos intoxicados con plantas calcinogénicas, teñidas con reacciones histoquímicas (HQ).

(a) Efecto patológico inducido por la aplicación de estrógenos en la próstata del novillo vacuno
Se sabe que el uso de anabólicos hormonales, para el engorde del ganado, puede llevar a un aumento de aproximadamente 10-20% de su peso corporal afectando, principalmente, su musculatura (3). Las drogas frecuentemente usadas son dietilstilbestrol (DES) o ésteres de DES, como dipropionato de DES, debido a su eficacia, precio, disponibilidad y estabilidad. El uso de DES ha sido prohibido en nuestro medio, principalmente en la producción de carne vacuna y aviar, debido a los riesgos en la salud pública, por sus propiedades carcinogénicas y teratogénicas. Si bien la administración de la droga es ilegal, es preocupante para muchos países del mundo. Asimismo, la aplicación de DES en los bovinos genera una hiperplasia y metaplasia escamosa del epitelio glandular prostático. La observación de estos cambios ha sido utilizada, desde hace mucho tiempo, como prueba diagnóstica de la inoculación ilegal.
Las citoqueratinas son un grupo complejo entre los filamentos del intermedios del citoesqueleto celular. En los diversos tipos de células epiteliales existen distintos tipos de citoqueratinas. Su determinación constituye un instrumento para el diagnóstico de cambios hiperplásicos y metaplásicos en el epitelio prostático.

(b) Características celulares de la subinvolución placentaria canina
La subinvolución de los sitios de placentación de la perra (SISP) es una rara entidad del puerperio canino (4). Esta alteración se asocia con una descarga vulvar serohemorrágica persistente desde el parto hasta las 6 a 12 semanas posteriores. Se desarrolla, principalmente, en perras de hasta 3 años de edad. Histológicamente, en esta entidad se observan células grandes y redondas de aproximadamente 50-55 µm, en el tejido conjuntivo entre las glándulas del endometrio. Su origen trofoblástico o decidual ha sido una cuestión de controversia. La determinación IHQ de filamentos intermedios permite conocer el origen de estas células.

(c) Aspectos morfológicos y fisiológicos de las poblaciones de neuronas GnRH del diencéfalo del coipo (Myocastor coypus)
La hormona liberadora de gonadotrofinas adenohipofisiarias (GnRH), aislada originalmente de cerebros ovinos y porcinos, es el neurotransmisor encargado de la liberación de las hormonas adenohipofisiarias, folículo estimulante (FSH) y luteinizante (LH), las cuales gobiernan la función reproductiva de los mamíferos, a través de la activación del eje hipotálamo-hipofiso-gonadal (5). Este péptido, secretado por neuronas de localización hipotalámica posee variadas funciones, actuando como neurotransmisor y neuromodulador de otras poblaciones neuronales. Se ha comprobado en ratas que las neuronas GnRH tienen una función reguladora sobre la hormona de crecimiento (STH), mediada por la terminación de axones GnRH en la neurohipófisis. En la rata, la totalidad de neuronas GnRH inmunoreactivas (GnRH-ir) fueron observadas en el hipotálamo rostral, area preóptica (POA), núcleo medial preóptico (MPON) y banda diagonal (DBB). El conjunto de datos existentes sobre neuronas GnRH es amplio y muestra algunos aspectos controversiales, sin embargo, el objetivo de este trabajo fue establecer la localización y distribución de las neuronas GnRH en una especie de roedor sudamericano (Myocastor coypus), aún no estudiada y establecer la cantidad de subtipos neuronales observados.

(d) Determinación el área y distribución de colágeno I y III en aortas de bovinos intoxicados con plantas calcinogénicas
La calcinosis enzoótica incluye las intoxicaciones crónicas con plantas calcinogénicas de los bovinos. La intoxicación con plantas calcinogénicas produce considerables pérdidas económicas en Argentina, Brasil, y Uruguay. Estas plantas contienen, principalmente, altos niveles de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3). Las lesiones se caracterizan por presentar calcificación de tejidos blandos y pérdida de la condición corporal. Dado que se desconocen los cambios que se inducen a nivel del tejido conjuntivo se realizó el estudio de fibras colágenas de tipo I y III, así como de diferentes fibras elásticas mediante tinciones HQ.

Tinciones: Los estudios IHQ se realizaron con la técnica del ABC, utilizando anticuerpos monoclonales específicos en cada uno de los apartados anteriormente mencionados ((a) Anti-citoqueratinas 13 y 16; (b) anti-desmina, vimentina y citoqueratinas; (c) anti-GnRH) (3-5). Todos los cortes fueron sujetos a la acción recuperadora de antígenos mediante la aplicación de ultrasonido, previo a la tinción inmunohistoquímica (7). Por su parte, los estudios HQ para la determinación de colágeno I y III se realizaron con la tinción con Sirius Red, mientras que para la determinación de fibras elásticas se emplearon las técnicas de Verhoeff, Weigert y Weigert-oxona (8).

Estudios morfométricos: Para la observación y captura de las imágenes se utilizó un microscopio trinocular (Olympus BX50 system microscope, Tokio, Japón). Las imágenes fueron capturadas mediante una cámara de vídeo RGB analógica (Sony DXC-151A CCD, Tokio, Japón) y digitalizadas a través de una placa digitalizadora (Flashpoint 128, Integral Technologies, Inc, Indianapolis, IN, USA) conectada a una computadora de alto rendimiento (PC Pentium III, 450 MHz, 128Mb RAM). Todas las imágenes fueron procesadas y analizadas mediante un analizador de imágenes específico para tal fin (Image-Pro Plus for Windows98 v4.1 (MediaCybernetics, Silver Spring, MA, USA))

Las imágenes microscópicas son capturadas a través de una cámara de video montada en el microscopio y conectada a una placa digitalizadora ubicada dentro de la computadora

Células basales de la próstata de un bovino estrogenizado, teñidas con técnicas IHQ, utilizando el anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina 13-16 como anticuerpo primario (200x)

Células similares a las citotrofoblásticas con reacción IHQ positiva al anticuerpo antipancitoqueratinas prsentes en la placenta subinvolucionada de la perra (100x).

Neuronas secretorias del hipotálamo del myocastor coipus teñidas con técnicas IHQ utilizando el anticuerpo monoclonal anti-GnRh como anticuerpo primario (400x).

Aorta de un bovino altamente intoxicado con vitamina D, teñida con Sirius red(400x).

Las imágenes capturadas fueron segmentadas por intensidad de color, luego de haber sido preprocesadas para eliminar la "suciedad de fondo" que pudiese estar presente en el corte histológico.

Segmentación de la Fig. 2

Segmentación de la Fig. 3

Segmentación de la Fig. 4

Segmentación de la Fig. 5

Posteriormente, se procedió a la calibración espacial, de acuerdo con la magnificación microscópica empleada y a la calibración lumínica, para establecer los rangos permitidos de densidad óptica. Luego de aplicar una mascara para ensombrecer los objetos no cuantificables, se transformó la imagen coloreada en una escala de grises, al efecto de facilitar la cuantificación.

Máscara de la Fig. 2

Máscara de la Fig. 3

Máscara de la Fig. 4

Máscaras de la Fig. 5

Estadística: Para la determinación del area inmunomarcada entre los diferentes grupos experimentales se empleó el análisis de la varianza, utilizando el método de Tuckey para establecer la significación de los resultados. Para determinar la significación de la densidad óptica de la reacción colorimétrica se empleó el test t de student de las diferencias entre grupos pareados.

Resultados numéricos expresados en histogramas o tablas

Resultados

La inmunomarcación de citoqueratinas en próstatas provenientes de animales estrogenizados permitió identificar células basales y determinar su número, lo cual permitió diagnosticar un estado de hiperplasia de dichas células, así como su densidad óptica. De igual forma, la inmunomarcación de filamentos intermedios en la placenta subinvolucionada de las perras permitió identificar las células presentes como similares a las citotrofoblásticas, ya que si bien difieren morfologicamente, ambas presentan citoqueratinas pero carecen de vimentina y de desmina. Por su parte, el suero anti-GnRh permitió ubicar a las neuronas secretoras, así como sus prolongaciones, dentro del hipotálamo del coipo. Finalmente, mediante la tinción con Sirius red, pudo establecerse la perdida de colágeno de tipo I, en las aortas de animales intoxicados con plantas solanaceas.

Discusión

Desde tiempos inmemorables el hombre ha tratado de clasificar elementos y registrar variaciones para comprender fenómenos físicos, químicos o biológicos. Así, la biología se ha basado en la medición de las formas de los organismos (morfometría) para comprender los fenómenos evolutivos. Hoy en día, la morfometría nos permite establecer normas que sirven para comprender los cambios patológicos o hacer seguimiento de tratamientos, a través de los cambios morfológicos observados en los órganos. Anteriormente, la anatomía descriptiva o la anatomía patológica permitía realizar estas observaciones. En la actualidad, estos mismos parámetros pueden ser obtenidos mediante técnicas relativamente sencillas, como las logradas a través de imágenes radiográficas, hasta procesos más complicados, como la sonografía y la sofisticación de la tomografía computada y la resonancia magnética nuclear.
Gracias a la histometría es posible medir parámetros tridimensionales (estereología), tales como el volumen ocupado por una estructura dentro de un tejido, la densidad volumétrica de un citoplasma, el número de células por volumen, etc., a partir de un corte histológico. Muchos de estos parámetros están directamente relacionados con la función del tejido y, por lo tanto, la correlación con los datos biológicos y fisiológicos puede aportar una información importante acerca de los mecanismos tisulares. Mediante la histometría es posible, además, estandarizar parámetros, de modo tal que los resultados obtenidos puedan ser considerados universales.
Las determinaciones histométricas se pueden obtener con el microscopio de luz con proyección del objeto sobre una pantalla o mediante objetivos reticulados y con registros fotográficos de microscopía óptica o electrónica. Existen también métodos cuantitativos semiautomáticos que permiten agilizar el proceso de cuantificación; pero sin dudas el uso de computadoras y de programas informáticos destinados al análisis de imágenes logra las cuantificaciones más exactas y repetibles.
El método utilizado en esta oportunidad para la cuantificación de las reacciones colorimétricas permitió, no solo identificar estructuras sino, además, establecer su número o área de tinción y su densidad óptica. Es sabido que existe una correlación entre la formación de inmunocomplejos y su densidad óptica (9). De igual forma, las reacciones estequiométricas permiten establecer una proporcionalidad entre las sustancias marcadas con la intensidad del color (8).
Ninguno de los métodos manuales (observación microscópica o análisis fotográfico) o semiautomáticos, permitiría obtener un dato objetivo de la densidad óptica de una reacción colorimétrica. Es por ello que el uso del análisis computarizado de imágenes es el ideal para la cuantificación de este tipo de reacciones. Sin embargo debe quedar claro que aún hoy, con el avance agresivo de la tecnología electrónica e informática, no existe una computadora capaz de reemplazar en un todo al ser humano. Nada, que el hombre no pueda conseguir mediante sus sentidos y su sapiencia puede ser logrado por una computadora. La computadora sin el hombre es tan solo un objeto inerte.

Bibliografia

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Fernández, PE; Sanguinetti, HR; Portiansky, EL; Barbeito, CG and Gimeno, EJ. Detection of illegal estrogen administration through immunohistochemical markers in the bovine prostate. Pesquisa Veterinaria Brasileira. (Brasilian Journal of Veterinary research). 19:133-138, 1999.

Fernández, P.E., Portiansky, EL., Barbeito, C.G. and Gimeno, E.J. Characterisation of cytotrophoblastic-like cells present in subinvolutioned placental sites of the bitch. Histology and Histopathology. 13(4):995-1000. 1998.

Silva, LB, Sanchez, HL, Acosta, W, Portiansky, E y Zuccolilli, GO. GnRH neurones population in the diencephalon of the coypu (Myocastor Coypus). Revista Chilena de Anatomía. Enviado 1999.

Portiansky EL, Alonso CR, Costa EF and Gimeno EJ. Quantification of collagen types I and III on the aorta of cattle poisoned by Solanum glaucophyllum (en preparación para su publicación).

Portiansky, EL. and Gimeno,E.J. A new epitope retrieval method for detection of structural cytokeratines in the bovine prostatic tissue. Applied Immunohistochemistry. 4:208-214. 1996

Montes GS. (1996). Structural biology of the fibres of the collagenous and elastic systems. Cell Biology International 20, 15-27.

Wells WA, Rainer RO, Memoli VA. Equipment, standardization, and application of image processing. Am. J. Clin. Pathol. 99:4856. 1993

Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración prestada por el Lic. Guillermo Casanovas para la realización del presente trabajo y a Tamar Ferguson por la traducción del manuscrito al inglés. ELP y EJG son miembros de la Carrera del Investigador Científico del CONICET (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología).

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